对于培养细胞样品的详细解说

<p>&nbsp;关于<strong>培养细胞</strong>样品：<br /> 1. 融解RIPA裂解液，混匀。取恰当量的裂解液，在运用前数分钟内参加PMSF，使PMSF的*终浓度为1mM。<br /> 2. 关于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍（假如血清中的蛋白没有搅扰，能够不洗）。依照6孔板每孔参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充沛触摸。一般裂解液触摸细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。<br /> 关于悬浮细胞：离心搜集细胞，用手指把细胞用力弹散。依照6孔板每孔细胞参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。再用手指轻弹以充沛裂解细胞。充沛裂解后应没有显着的细胞沉淀。假如细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。<br /> 3. 充沛裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。<br /> 裂解液用量阐明：一般6孔板每孔细胞参加150微升裂解液现已足够，但假如细胞密度十分高能够恰当加大裂解液的用量到200微升或250微升。<br /> 关于安排样品：<br /> 1. 把安排剪切成细微的碎片。<br /> 2. 融解RIPA裂解液，混匀。取恰当量的裂解液，在运用前数分钟内参加PMSF，使PMSF的*终浓度为1mM。<br /> 3. 依照每20毫克安排参加150-250微升裂解液的份额参加裂解液。（假如裂解不充沛能够恰当增加更多的裂解液，假如需求高浓度的蛋白样品，能够恰当削减裂解液的用量。）<br /> 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充沛裂解。<br /> 5. 充沛裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。<br /> 6. 假如安排样品自身十分细微，能够恰当剪切后直接参加裂解液裂解，经过激烈vortex使样品裂解充沛。然后同样离心取上清，用于后续试验。直接裂解的长处是比较便利，不用运用匀浆器，缺陷是不如运用匀浆器那样裂解得比较充沛。<br /> 注：RIPA裂解液的裂解产品中经常会呈现一小团通明胶状物，属正常现象。该通明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别严密的蛋白的情况下，能够直接离心取上清用于后续试验；假如需求检测和基因组结合特别严密的蛋白，则能够经过超声处理打碎打散该通明胶状物，随后离心取上清用于后续试验。假如检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，一般不用进行超声处理，就能够检测到这些转录因子。</p>