RNA逆转录实验5大注意事项

<p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; RNA逆转录实验看似简单，却常常因为一些细节问题导致结果不理想，甚至实验失败。本文将揭示RNA逆转录实验中常见的5大误区，帮助您避开这些陷阱，获得高质量的实验结果。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 1.防止RNA模板降解</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 毫无疑问，RNA的质量对cDNA合成的结果有着重要的影响。但RNA本身比较脆弱，容易降解。为了保证RNA的完整性，需要谨慎小心，例如在冰上操作、减少操作时间等。在反应体系中添加抑制剂也能有效防止RNA降解。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 另外，建议在逆转录前通过琼脂糖凝胶电泳检查RNA条带的质量。通常完整的真核RNA应该包含28S和18S条带，且28S条带的强度一般约为18S的两倍。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 2.RNA定量</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 除了掌握RNA的完整性外，逆转录前还需要测定RNA的浓度。一般逆转录试剂盒对上样量都有要求，建议总RNA上样量小于5&mu;g。超过此范围会造成逆转录产物的偏向性（表达丰度高的基因优先被逆转录），从而导致定量结果不准确。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 3.去除基因组DNA污染</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 残留的基因组DNA（gDNA）会严重干扰荧光定量结果。为了使结果更真实、可重复，需要去除gDNA干扰。可以在引物设计时避免gDNA扩增，例如将上下游引物设置在不同的外显子上；或在RNA提取后使用DNaseI去除gDNA。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 4.选择合适的引物</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; OligodT引物和随机引物均可进行逆转录。OligodT引物仅能结合mRNA3'端的poly(A)，不受rRNA和tRNA的干扰，特异性强。但其对RNA的完整性和二级结构要求较高，不适用于原核生物。随机引物几乎可以结合任何RNA，包括mRNA、tRNA和rRNA，具体取决于碱基。但随机引物法逆转录产生的片段较小，难以获得全长转录本的cDNA。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 5.逆转录酶的热稳定性</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 逆转录酶在整个逆转录体系中起着关键作用。除了活性之外，逆转录酶的热稳定性也至关重要。在较高温度下进行逆转录可以降低RNA的二级结构，提高逆转录效率。野生型M-MLV逆转录酶非常&ldquo;耐热&rdquo;，当温度高于37℃时，其稳定性会大大降低。</span></p> <p><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></p> <p><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; RNA逆转录实验的成功与否，往往取决于细节。牢记这5大注意事项，让您的PCR实验事半功倍，高效获取高质量数据。</span></p>