告别废数据！ELISA吸光度测量的"黄金法则"

<div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 吸光度（A），又称光密度（OD）。OD值这个概念，做实验的朋友们想必都很熟悉。从判断提取核酸的质量和浓度，到BCA蛋白定量进行蛋白定量，或是ELISA实验检测目标蛋白的含量，这些常用的基础实验都需要测试样品的&ldquo;OD值&rdquo;，但&ldquo;OD值&rdquo;究竟是什么？测&ldquo;OD值&rdquo;时我们需要注意哪些问题呢？今天我们就来聊聊这里。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; </span><strong><span style="font-size: 12px;">什么是&ldquo;OD&rdquo;值？</span></strong></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; OD（OpticalDensity）的缩写，即光密度，也可以称为吸光度。吸光度是指利用物质特有的吸收光谱来识别物质或测定其含量。将特定波长的光束照射到待检测物体上，待检测物体会吸收部分光，通过吸光度计算出待检测物体的浓度值。一般来说，待检测物质的浓度越高，吸光度值就越高。实验中，也会利用&ldquo;OD值&rdquo;与待检测物质浓度之间的关系来确定吸光度。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> &ldquo;OD&rdquo;值检查工具</span></strong></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶标仪，即酶联免疫检测仪，用于检测ELISA反应后的吸光度值。它主要由光路系统和信号采集系统组成。其工作原理为：</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 光源灯发出的光波经过滤光片或单色器转变为一束单色光，一部分单色光被标本吸收，另一部分透射过标本照射到光电探测器上；</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 光电探测器将光信号转换成相应的电信号，经过一系列的信号处理后，送入微处理器进行数据处理和计算，最后将结果显示出来。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp;</span><strong><span style="font-size: 12px;"> 实验中测量&ldquo;OD值&rdquo;的注意事项</span></strong></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 测量时最需要注意的是光的波长。在介绍&ldquo;OD值&rdquo;这个概念时提到，吸光度利用的是物质特有的吸收光谱。实际操作中我们需要注意的正是这一点。不同物质的吸收光谱不同，最大吸收峰的波长也不同。为了达到最佳的测量效果，一般来说，我们需要在待测物质的最大吸收波长处检测其&ldquo;OD值&rdquo;。例如，核酸在260nm波长处吸收最大光，而蛋白质和酚类物质在280nm波长处吸收最大光。用BCA法检测蛋白质含量时，显色反应后溶液由浅绿色变为紫色，此时在560nm处有一个最大吸光值；在采用TMB法的ELISA实验中，加入终止液后溶液由蓝色变为黄色，在450nm处有最大吸光值。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 除了吸收波长外，有些实验还需要设置一个校正波长。校正波长通常远离最大吸收波长，作为背景吸收，消除气泡、灰尘等系统误差造成的&ldquo;OD值&rdquo;偏差。双波长校正以测得的&ldquo;OD值&rdquo;为基础，可以有效降低系统误差的影响。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 测得的待测样本&ldquo;OD值&rdquo;仍然需要进行折算才能得到最终浓度。很多科研人员经常在这一步犯错，功亏一篑。需要注意的也比较简单，就是按照相应试剂盒的说明书，使用推荐的曲线拟合方法进行拟合。拟合完成后，需要查看拟合曲线的R2值。如果接近1，证明曲线拟合度越高，结果越可信。如果R2值偏低，则需要检查是否存在标准品稀释问题或实验操作失误。选择错​​误的拟合方法会影响曲线拟合度，R2值偏低，回归计算出的待测样本浓度也会不准确。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; <strong>温馨提示</strong>：BCA蛋白定量实验及ELISA实验的显色过程受反应时间、温度等条件影响，需根据实验情况及时终止实验才能读数。</span></div>