一文细说酶偶联抗体及其作用

<div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶标记物包括酶标抗原、<a href="/category-23-b0.html">酶标抗体</a>、酶标SPA等。酶标记物的质量直接关系到免疫酶技术的成功，被称为关键试剂。最常用的酶标记物是酶标抗体，它是将酶和特异性抗体通过适当的方法连接而成。酶标抗体的质量，主要取决于酶和抗体的纯度好、活性强、亲和力高，其次取决于良好的制备方法。制备方法宜选择产率高，不影响结合物活性，不混入干扰物质，简单易操作的方法。</span></div> <div style="text-align: center;"><span style="font-size: 12px;"><img src="/images/upload/Image/图 1_ 抗体-酶结合方法示意图。(Ozkan B等人；2019).jpg" alt="抗体-酶结合方法示意图" width="500" height="126" /><br /> </span></div> <div style="text-align: center;">&nbsp;</div> <div style="text-align: center;">图1&nbsp;图 1. 抗体-酶结合方法示意图。(Ozkan B等人；2019)</div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶制剂及其底物</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 原则上，任何无毒、能呈现有色化学反应的酶均可作为标记物。但用作标记抗体的酶应满足以下要求：</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; （1）来源方便，易于纯化；</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; （2）比活高，性质稳定；</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; （3）酶活力和酶量测定方法简便。免疫酶技术中常用的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），其次是葡萄糖氧化酶、&beta;-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶等。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 辣根过氧化物酶（HRP）因其比活高、稳定性好、分子量小、纯酶易制备等特点，是最常用的酶。HRP广泛分布于植物界，在辣根中含量较高。它是由无色酶蛋白和棕色铁卟啉组成的糖蛋白，含糖量为18%。HRP由多个同工酶组成，分子量为40000，等电点为PH3~9。酶催化的最适pH值因供氢体不同而略有不同，但大多在PH5左右。该酶可溶于水和饱和度小于58%的硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白的最大吸收光谱分别为403nm和275nm。酶的纯度一般用OD403nm/OD275nm的比值RZ（德国莱茵兰-普法尔茨法）表示。高纯度酶的RZ值应在3.0左右（最高可达3.4）。RZ值越小，非酶蛋白含量越高。需要注意的是，纯度并不代表酶活性。例如，当酶变性时，RZ值可能保持不变。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; HRP的催化反应需要底物过氧化氢（H2O2）和氢供体（DH2）。氢供体多为无色还原染料，反应可生成有色氧化染料（D）。氢供体的种类繁多，形成的产物特性各异。例如，DAB（3,3-二氨基联苯胺）的反应产物为不溶性沉淀，且具有电子密度，适合用于免疫酶染色或电镜观察。5AS（5-氨基水杨酸）早期用于ELISA，但其溶解度不够高，空白孔难以控制无色，现已很少使用。OT（邻甲苯胺）的特点是能生成鲜艳的蓝绿色产物，灵敏度高，但反应受温度影响较大，且由于产物不稳定，需要在短时间内测定。目前应用较为广泛且较为满意的氢供体有：OPD（邻苯二胺）和TMB（四甲基联苯胺）。前者生成的产物为深橙色或棕色，后者的产物为蓝绿色。二者溶解性均较好，在暗处显色稳定，空白可接近无色。据报道，后者的灵敏度可比前者提高4倍。此外，还有一种氢供体ABTS（2,2'-边氮-双(3-乙基苯并硫代吡咯烷-6磺酸)），其反应产物呈蓝绿色，灵敏度和稳定性均较好。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 由于HRP的底物H2O2本身是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2用量不能过量，应控制在较短的反应时间后，颜色达到峰值（表明H2O2已耗尽）。这样，即使延长时间，反应产物的颜色也不会加深。</span></div> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <h3><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 如何标记抗体</span></h3> <div><span style="font-size: 12px;"><br /> </span></div> <div><span style="font-size: 12px;">&nbsp; &nbsp; 酶与抗体的交联方法有很多种，根据酶的结构可采用不同的方法。对于HRP偶联物的制备，可采用戊二醛两步法和高碘酸钠法。其中，较为常用的是简单的高碘酸钠法。</span></div> <p>&nbsp;</p>