酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。
酶标记物中常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。
目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。
酶联生物酶标记物工作浓度的选择
在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。另外,由于浓度过高,可使非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此,正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是:将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称工作浓度。
其步骤为:
先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1ml,4℃过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600……(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小时后洗涤。
然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分钟。以2M H2SO40.05ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右,且曲线斜率时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。
有关试验的试剂及器材均见ELISA部分:
要说明的是,本法为ELISA直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中,因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到合适的实验条件。欢迎来电咨询具体关于酶标记物动态。
上海酶联生物科技有限公司
Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd.
订购热线:4008-898-798 / 021-54720761
传 真:021-54222852
地址:上海市松江区云凯路66号T2楼1603室
酶联官方手机二维码
微信扫描二维码,参与酶联活动,
劲爆优惠触手可得!
本网站销售的所有产品仅用于工业应用或者科学研究等非医疗目的,不可用于人类或动物的临床诊断或治疗,非药用,非食用。