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感受态细胞 >
根癌农杆菌感受态细胞EHA105(pSoup)Chemically Competent Cell说明书产品货号: ML-G2040-2
保存条件: -80℃
产品规格: 10×100μl 50×100μl 100×100ul
产品介绍基 因 型C58 (rifR) Ti pEHA105 (pTiBo542DT-DNA) Succinamopine (pSoup-tetR)简 要 说 明MLBioEHA105菌株由EHA101菌株改造而来,为C58型背景,核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pEHA105 (pTiBo542DT-DNA),此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pEHA105 (pTiBo542DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。在EHA105菌株中转入help质粒:pSoup即为EHA105 (pSoup)菌株,可帮助pGreen,62SK,pGs2系列质粒在农杆菌中复制,同时赋予该菌株四环素(tet)抗性,适用于水稻、烟草等植物的转基因操作。MLBio生产的EHA105(pSoup)化学转化感受态细胞经特殊工艺制作,pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。操 作 说 明1.取-80℃保存的MLBio农杆菌感受态于冰上待其部分融化,处于冰水混合状态时插入冰中。2.每100μl感受态加1ug(体积不大于10ul)质粒DNA,用手拨打管底混匀,依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、28℃水浴5分钟、冰浴5分钟。3.加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基,于28℃振荡培养2~3小时。4.6000rpm离心一分钟收菌,留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上,倒置放于28℃培养箱培养2-3天(当平板只含有50ug/ml kan 时,28℃培养48h即可;平板中同时加入50ug/ml kan,20ug/ml rif 时,需28℃培养60h;如果使用的平板含有50ug/ml rif 则需要28℃培养72-90h)。注 意 事 项1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10 ;质粒不纯或存在乙醇等有机物污染,转化效率急剧下降;质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。2.混入质粒时应轻柔操作。3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。4.利福平浓度不应高于25ug/ul,过高的利福平浓度不利于农杆菌生长,会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50ug/ml kan,若所用平板含有20ug/ml rif则转化效率降低到1/2。5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌;根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止Ti质粒丢失,但链霉素不利于农杆菌的转基因操作,所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素,Ti质粒丢失的概率极低备 注1、农杆菌相关抗生素配方:
抗生素
配方
原液
工作液
羧苄青霉素(carb)
双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌
50 mg/ml
50 μg/ml
硫酸卡那霉素(kan)
双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌
50 mg/ml
50 μg/ml
链霉素(strep)
双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌
10 mg/ml
50 μg/ml
利福平(rif)
DMSO溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌
10 mg/ml
20 μg/ml
庆大霉素(gent)
双蒸水溶解,0.22 μm滤膜过滤除菌
20 mg/ml
40 μg/ml
2、常用农杆菌抗性:(R:抗;S:敏感。)
农杆菌菌株
羧苄青霉素(carb)
链霉素(strep)
利福平(rif)
庆大霉素(gent)
硫酸卡那霉素(kan)
AGL-1
R
S
R
S
S
EHA101
S
S
R
S
R
EHA105
S
S
R
S
S
LBA4404
S
R
R
S
S
GV3101
S
S
R
R
S
3、LB及YEB配方:
component
LB(液体)/L
LB(固体)/L
component
YEB(液体)/L
YEB(固体)/L
Tryptone
10 g
10 g
产品标签
用户评论(共6条评论)
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